1、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫方法分類

目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的建庫方法基本可以按照技術(shù)方案分為兩類：

1）一類依賴于孔板

通俗的說，就是將已經(jīng)解離的單個(gè)細(xì)胞分配到孔板中各自的孔中，在孔中單個(gè)細(xì)胞完成裂解、RNA富集、加細(xì)胞條碼( cell barcode )和單分子識(shí)別碼(UMI)等步驟后再收集到一起進(jìn)行測序。

而具體的實(shí)施方案會(huì)根據(jù)每種建庫方案有一些特色型的變動(dòng)。目前這一類方法包括CEL-seq、CEL-seq2、SMART-seq、SMART-seq2、Microwell- seq等。

特點(diǎn):

a.基于孔板的建庫方法總體來說難以達(dá)到很高的通量

如SMART-seq2是基于96孔板，那么同批次只能測96個(gè)單細(xì)胞；microwell-seq通過縮小孔的體積擴(kuò)大了可以同批量測序的細(xì)胞數(shù)目。

b.有基于全長轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序的條件

2）另一類依賴于液滴

大致可以理解為通過微流控技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞和一個(gè)捕獲RNA的微珠(beads)包裹在液滴中，beads連接的mRNA捕獲oligo上已經(jīng)預(yù)先包含cell barcode和UMI信息，在液滴中完成至少mRNA的富集后再將微珠合并，完成建庫并測序。

具體的實(shí)施方案也是隨著不同的方法學(xué)有些許差異。目前這-類方法包括Drop-seq、inDrop、10x genomics等。

特點(diǎn):

a.基于微流控液滴的單細(xì)胞測序建庫的優(yōu)點(diǎn)是可以短時(shí)間內(nèi)同批次處理更多細(xì)胞(數(shù)千以上)，但由于beads對(duì)mRNA的捕獲率所限，這種方法在獲得細(xì)胞數(shù)量的突破的同時(shí)，可以測到的基因數(shù)減少。

b.這類方法仍主要采用3'末端建庫的方式(只取cDNA的3'末端測序)，所以在基因比對(duì)和定量的準(zhǔn)確度上有所不及。

3）其他

SPLiT-seq以細(xì)胞本身作為“EP管"，將細(xì)胞膜穿孔后進(jìn)行多輪split-pool的原位barcode連接，待每單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的RNA理論上均帶有細(xì)胞特異性tag后再pool together。

2、幾種常用的scRNA-seq實(shí)驗(yàn)方法

圖片來源：【豪克博士聊科研】教你單細(xì)胞測序（五）操作流程（4） - 知乎

目前常見的單細(xì)胞測序方法主要有：Smart-seq2、CEL-seq2、sci-RNA-seq、10x Chromium、Drop-seq、Seq-Well、inDrops。

圖片來源：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序簡介-OmicsClass

其中Smart-seq2、CEL-seq2是基于微孔板的方法進(jìn)行測序，屬于低通量測序。

sci-RNA-seq是基于微孔板組合的方法來隔離細(xì)胞并標(biāo)識(shí)細(xì)胞，屬于高通量的分析方法。

10x Chromium、Drop-seq、inDrops是基于微流控產(chǎn)生的油包水的方法來隔離細(xì)胞，并且是用帶barcode序列的引物微珠來標(biāo)識(shí)細(xì)胞的，是高通量的方法。

Seq-Well采用微孔芯片來隔離細(xì)胞，再用微珠來標(biāo)識(shí)細(xì)胞，屬于高通量方法。

1）Drop-seq

Drop-seq是一種基于使用微流體技術(shù)快速分析數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的方法，Drop-seq測序的原理是利用微流控裝置將帶有條形碼的微珠和細(xì)胞一起裝入微液滴，該微液滴相當(dāng)于一個(gè)納升大小的反應(yīng)室，可以將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離，從而單獨(dú)進(jìn)行建庫和測序。

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Drop-seq針對(duì)cDNA的3'末端測序。

2）CEL-seq／CEL-seq2

?CEL-seq

CEL-seq通過體外線性擴(kuò)增（In vitro transcription, IVT）實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測序。

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a.RT

分離單細(xì)胞后，利用含條形碼（barcode）的引物對(duì)每管的單細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

該引物含有錨定的ploydT、barcode、5' Illumina測序接頭和一個(gè) T7 promoter。

b.cDNA第二鏈的合成

合成第二條鏈后，形成的就是雙鏈的DNA。

c.體外轉(zhuǎn)錄

將所有的cDNA樣本混合到一起，以達(dá)到足以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（In vitro transcription, IVT）的模版量。

T7 promoter用于啟動(dòng)IVT，以第二條合成的DNA 為模版轉(zhuǎn)錄RNA（所以此時(shí)的RNA序列與原 mRNA序列是反向互補(bǔ)的，即antisense RNA，aRNA），此時(shí)5'端最外為Illumina 5' adaptor。經(jīng)過多輪 IVT，實(shí)現(xiàn)模版的線性擴(kuò)增。

d.文庫構(gòu)建

擴(kuò)增好的RNA進(jìn)一步進(jìn)行片段化（適合測序的片段長度），同時(shí)在RNA的 3' 加接頭(Adaptor)。

進(jìn)一步對(duì)這些RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為DNA，同時(shí)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段即為建好的庫，然后對(duì)這些片段進(jìn)行paired-end測序。read1記錄barcode信息，read2用于確定mRNA。

?CEL-seq2

CEL-seq2與CEL-seq的不同主要體現(xiàn)在使用了 Fluidigm C1微流體平臺(tái)，同時(shí)引物增加了 UMI 部分，確保每一個(gè)反轉(zhuǎn)錄mRNA被精確的計(jì)數(shù)一次。

圖片來源：這么多單細(xì)胞測序平臺(tái)，我該選哪個(gè)？-知乎

相較 CEL-seq，做出了一些改進(jìn)：

圖片來源：你真的搞懂了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組嗎？-科研這點(diǎn)事兒

a.RT引物中加入了一段6nt的UMI，將8nt的 barcode縮短至6nt，并縮短T7引物和Illumina 5'接頭，使引物總長從92nt縮短至82nt，提升了RT效率。

b.RT時(shí)使用SuperScript II，并在第二條鏈合成時(shí)使用SuperScript II Double-Stranded cDNA Synthesis Kit。

c.改進(jìn)了去除 dsDNA和 aRNA的過程，提高產(chǎn)量。

d.IVT得到的RNA在反轉(zhuǎn)錄時(shí)，直接插入接頭，不需要進(jìn)行連接。

3）MARS-seq

MARS-seq的原理與CEL-seq類似，均是通過T7 啟動(dòng)子連在oligo dT引物上，可以在cDNA合成后啟動(dòng)IVT。

圖片來源：【豪克博士聊科研】教你單細(xì)胞測序（五）操作流程（4） - 知乎

但與CEL-seq不同的是，MARS-seq在單細(xì)胞分離時(shí)，主要使用的是FACS流式分選，而CEL-seq2/C1單細(xì)胞采用細(xì)胞稀釋法。

MARS-seq2.0是在MARS-seq基礎(chǔ)上，整合index 分選以及大量平行單細(xì)胞RNA測序方法，從而形成的一套流程。MARS-seq2.0引物包含T7啟動(dòng)子、6bp的barcode 以及8bp的UMI，待單細(xì)胞被FACS分選后，進(jìn)一步將單細(xì)胞置入384孔板中。

4）SCRB-seq

SCRB-seq與Smart-seq相似，均是通過PCR的方式對(duì)擴(kuò)增cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。

但與Smart-seq不同的是，SCRB采用UMI主要對(duì) RNA 3'進(jìn)行富集，而Smart-seq對(duì)mRNA的全長進(jìn)行分析，兩者還是不一樣的。

SCRB-seq的主要流程：

a.FACS單細(xì)胞分選后，加入微孔中；

b.裂解細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物含有oligo dT、10bp UMI、6bp barcode以及PCR引物部分；

c.第二鏈的擴(kuò)增，主要采用PCR的方式進(jìn)行擴(kuò)增；

d.進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行PCR指數(shù)擴(kuò)增；

e.PCR產(chǎn)物片段化并進(jìn)行3' 端富集；

f.建庫測序。

5）inDrop-seq

inDrop，Drop-seq和10X Genomics使用相似的原理產(chǎn)生微滴，且磁珠引物具有相同的結(jié)構(gòu)，包括PCR柄、細(xì)胞條形碼、特異性分子標(biāo)記（UMI）和poly-T。

?inDrop，Drop-seq和10X Genomics差異點(diǎn)

圖片來源：國人一區(qū)作品：基于微滴的超高通量單細(xì)胞RNA-Seq系統(tǒng)的比較分析（IF=14.548）-小桔燈網(wǎng)

a.inDrop系統(tǒng)磁珠引物包含光裂解序列和T7啟動(dòng)子。

b.磁珠材料：10X和inDrop系統(tǒng)使用的磁珠是水凝膠制成的，Drop-seq使用的是脆性樹脂。

c.10X Genomics磁珠和inDrop磁珠可以固定整個(gè)珠子的引物，而Drop-seq磁珠只能在表面攜帶引物。

d.通常，微滴和細(xì)胞以低濃度引入，以減少形成雙重態(tài)的機(jī)會(huì)；也就是說，兩個(gè)細(xì)胞或兩個(gè)珠子被封裝在一個(gè)微滴中。包封后，10X Genomics整粒磁珠溶解，將所有的引物釋放到溶液中，提高mRNA的捕獲效率。inDrop通過uv照射，通過裂解來激活引物。Drop-seq使用表面連接的引物來捕獲mRNA分子。

e.反轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)：10X Genomics和inDrop是在微滴內(nèi)進(jìn)行，相反，Drop-seq只捕獲轉(zhuǎn)錄本，沒有進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

f.cDNA擴(kuò)增方式：inDrop使用CEL-seq，而10X Genomics和Drop-seq遵循template-switching，類似于流行的Smart-seq。

g.文庫制備時(shí)間：inDrop的微滴外轉(zhuǎn)錄，文庫制備時(shí)間延長至24小時(shí)以上，而Drop-seq和10X Genomics均可在一天內(nèi)完成。

?inDrop-seq建庫流程

a.在微流設(shè)備中有4個(gè)輸入通道，分別是BHMs，細(xì)胞，RT/lysis試劑以及油，封裝成微滴；

b.利用UV釋放BHMs上的引物，與裂解細(xì)胞得到的 mRNA結(jié)合，進(jìn)行RT；

c.破壞微滴后將所有cDNA整合，按照CEL-seq protocol進(jìn)行測序；

圖片來源：文獻(xiàn)解讀 用于研究發(fā)育、生理和疾病的單細(xì)胞RNA測序_scRNA-

6）CITE-seq

CITE-seq是利用寡核苷酸標(biāo)記的抗體，對(duì)細(xì)胞表面蛋白和轉(zhuǎn)錄組同時(shí)進(jìn)行測定的技術(shù)。

單細(xì)胞測序的部分和10X的原理是一樣的，只是CITE-seq在原有單細(xì)胞測序的基礎(chǔ)上加了抗體，抗體可以結(jié)合到細(xì)胞表面相應(yīng)的蛋白上，抗體上帶有特殊的DNA標(biāo)簽。

?CITE-seq建庫流程

a.設(shè)計(jì)DNA-barcoded antibodies

通過鏈霉親和素-生物素互作，將寡核苷酸5'端與抗體相連，而這種通過二硫鍵的結(jié)合會(huì)在還原條件下斷裂，釋放寡核苷酸。

圖片來源：CITE-seq：同時(shí)測細(xì)胞表面蛋白和RNA的單細(xì)胞測序

寡核苷酸中包括用于PCR擴(kuò)增的handle，用于抗體身份識(shí)別的barcode，以及能與oligo-dT引物結(jié)合的一段polyA序列。

b.液滴生成

將antibody-oligo復(fù)合物與單細(xì)胞懸液共孵育（條件設(shè)置參照流式細(xì)胞染色），抗體和細(xì)胞結(jié)合后洗去未結(jié)合的抗體，隨后樣本即可對(duì)接10x技術(shù)被分成油包水小液滴。

c.細(xì)胞裂解和逆轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞裂解，使得帶有oligo-dT的beads與細(xì)胞 mRNA及抗體-寡核苷酸復(fù)合物3'端的polyA尾巴結(jié)合，然后對(duì)同一細(xì)胞的mRNA和寡核苷酸進(jìn)行RT 和PCR，并標(biāo)記上相同的cell barcode。

擴(kuò)增了的來源于抗體的序列(ADTs)和cDNA分子能夠通過大小區(qū)分開，從而分別進(jìn)行Illumina測序文庫的制備。

由于兩種文庫可以獨(dú)立生成，因此可以調(diào)整其在單個(gè)lane中的比例以確保各自所需的測序深度。

?CITE-seq的優(yōu)點(diǎn)

a.同時(shí)測mRNA+蛋白信息，數(shù)據(jù)更豐富，對(duì)細(xì)胞的注釋更準(zhǔn)確，有助于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型。

b.由于barcode的存在，CITE-seq檢出的mRNA+蛋白是可以對(duì)應(yīng)的，也就是說是可以同時(shí)得到每個(gè)細(xì)胞的mRNA+蛋白表達(dá)量。

c.與流式細(xì)胞相比，CITE-seq又可以不受抗體之間信號(hào)干擾的影響，大大增加了表面蛋白標(biāo)記的數(shù)量(一次可以檢出多達(dá)100個(gè)的蛋白)，從而可以一次性獲得多種由抗體蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果關(guān)注點(diǎn)在細(xì)胞蛋白上，ADTs可以獨(dú)立于細(xì)胞的mRNA而單獨(dú)測序、分析。

d.CITE-seq能夠與10X Genomics無縫銜接，方便易操作。

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